Capitol II - Metode de cercetare - Pagina 3

: Categorie: Atractii Cernica Atractii Cernica; Publicat: 05 Ianuarie 2011 05 Ianuarie 2011; Accesări: 31130 31130

Evaluare utilizator: 3 / 5

Index articole

Pagina 3 din 5

CAPITOLUL II

Metode de colectare şi cercetare

Gasteropode

Colectare. Gasteropodele cu cochilie pot fi adunate din frunzar sau de pe diferite plante direct cu mâna sau cu o pensetă şi le depozităm fie în cutii de carton de dimensiuni diferite, fie în tubuşoare de sticlă. Uneltele necesare pentru colectare şi metodele întrebuinţate sunt următoarele: o mică greblă cu trei-cinci dinţi, cu mâner scurt, cu ajutorul căreia putem răscoli frunzarul sau răsturna pietrele şi buştenii din pădure.

Săculeţul din pânză poate avea dimensiuni mari sau mai mici servind la depozitarea speciilor mai mari. Săculeţul este necesar pentru transportul frunzarului sau al pământului din apropierea arborilor în care, se adăpostesc numeroase specii mici, greu de observat cu ochiul liber. Tot în săculeţ se poate transporta şi pământul cu rădăcinile ierburilor, unde se găsesc specii mici. Săculeţul se va strânge la gură cu un şnur după ce s-a pus eticheta cu locul şi data de colectare.

Carnetul de teren. Uneori e necesar să cunoaştem mai multe amănunte despre condiţiile ecologice, temperatură şi natura subsolului, toate putând servi la determinarea speciei şi urmări rolul pe care-l are aceasta în circuitul masei vii din zona respectivă.

Fileul este construit dintr-o pânză cu fir tare cu o ramă de metal şi cu un mâner lung. Pentru a-l manipula, îl apucăm de mâner şi dăm repede în dreapta şi stânga prin iarbă, iarba fiind înaltă se va apleca în faţa fileului lăsând să cadă în el melcii care eventual s-ar găsi în ea.

Operaţia se realizează dimineaţa când datorită umidităţii melcii se găsesc pe plante. Materialul colectat cu fileul se pune într-un săculeţ de pânză notând datele necesare.

Ciurul şi sita: o cutie de metal circulară al cărei fund este alcătuit dintr-o pânză metalică. Luăm frunze uscate şi le cernem. Se pot întrebuinţa site cu ochiuri variate ca dimensiune făcându-se astfel o triere mai selectivă. Dacă rămân amestecate cochiliile cu pietricele răsturnăm acest produs într-un vas cu apă curată, iar melcii fiind mai uşori vor reveni la suprafaţă.

Transportul. Dacă dorim să studiem acasă melcii se recomandă pentru transport o cutie de tablă cu 1-2 pereţi de sită în interiorul ei punând ca ambalaj diferite frunze verzi pentru ca melcii să nu fie în contact direct unii cu alţii.

Preparare Odată transportat în laborator materialul colectat trebuie preparat pentru determinare şi pentru colecţie, împiedicând astfel alterarea rapidă şi mirosul neplăcut provenit din materiile fecale sau din descompunerea celor morţi.

Dacă urmărim numai caracterele cochiliei acestea pot fi observate direct, iar dacă facem studii anatomice, atunci luăm numărul necesar de exemplare şi le punem în sticle complet pline cu apă fiartă pentru a avea cât mai puţin oxigen şi animalul ieşind din cochilie va muri prin asfixiere. După ce ţinem în apă rece cel mult 24 h. putem face deîndată studii anatomice, prin disecţii sau punem animalele astfel omorâte în tuburi speciale cu alcool 70 %, unde pot fi păstrate vreme îndelungată, cu mare grijă însă ca acestea să fie acoperite complet. Prepararea numai pentru cochilie se face lăsându-se să moară în interiorul cochiliei, în cutii de lemn, deci cu aerisire. Animalul se va retrage în interiorul cochiliei şi se va usca încetul cu încetul fără a produce miros de putrefacţie. Colecţiile pentru animalele fără cochilii, ca şi pentru cele cu cochilii astfel preparate trebuie păstrate la întuneric, pentru că lumina solară decolorează atât cochilia cât şi tegumentul animalului, acestea deseori prezentând caractere fundamentale. Dacă dorim să păstrăm în colecţie numai cochiliile de la unele specii mai mari atunci trebuie să scoatem animalul din ele. Punem melcii într-un vas cu apă fiartă, îl lăsăm numai câteva minute, timp în care animalul se va retrage repede în cochilie şi va muri. Cu un ac lung şi puternic al cărui capăt să fie îndoit ca un cârlig, se introduce în partea moale a animalului pentru a fi scos afară. De obicei muşchiul columelar care-l fixează de cochilie cedează repede şi el poate fi scos în întregime afară. Dacă mai rămâne o mică parte atunci prin clătire bruscă cu apă acesta cedează, iar cochilia va rămâne complet goală.

Deseori însă pentru determinarea speciei este nevoie de maxilă şi randulă. Din partea moale a animalului se separă cu ajutorul unei pense maxila, cu ochiul liber, iar pentru randulă se poate scoate bulbul randular pentru a macera partea moale într-o eprubetă cu hidrat de sodiu, părţile chitinoase rămânând astfel neatinse. Acestea vor fi păstrate în tubuşoare şi pentru siguranţă vor fi puse alături de cochilia animalului respectiv.

Şi pentru studiul anatomic trebuie să aplicăm anumite metode şi să dispunem de un minim de instrumente. În cazul disecţiei anatomice necesare determinării speciei, trebuie să urmărim tubul digestiv dacă are sau nu anumite anexe, forma şi încolăcirea acestuia în corp, forma glandelor salivare şi forma stomacului; este necesar studierea sistemului excretor, a muşchiului tentaculului drept (dacă este sau nu încrucişat cu sistemul genital sau este liber pe lângă acesta), dar mai ales de valoare deosebită este anatomia sistemului genital, fie că animalul e unisexuat, fie că este hermafrodit. Pentru studierea acestor caractere, animalul este scos din cochilie dacă o are sau dacă este vorba de specii fără cochilie, este întins pe fundul unui cristalizator având pe fund un strat de parafină colorată în negru sau brun, prin amestec cu negru de fum sau cu ceară de albine, pentru a se putea distinge diferitele organe care de obicei au culoarea albă. Se va scoate organul căutat din corpul animalului pentru a fi observat. Radula şi aparatul genital se fixează pe lama de sticlă în balsam de Canada şi se păstrează astfel pentru a fi studiat la binocular sau la microscop.

Pentru studii anatomice este nevoie de foarfeci, pensete, ace de diferite dimensiuni cu care se vor separa organele, înfigându-le în fundul parafinat al cristalizatorului. Disecţia se execută la lupa binoculară. Masa viscerală se pune în evidenţă numai după îndepărtarea cochiliei. În acest scop cu o foarfecă al cărei vârf se introduce între cochilie şi manta se urmăresc turele de spiră până la apexul cochiliei. Apoi, cu o uşoară mişcare de desrăsucire a columelei cu precauţia de a nu strivi masa viscerală se înlătură cochilia în întregime. Operaţia următoare presupune doi timpi:

1. Deschiderea cavităţii paleale pentru studierea complexului paleal.

2. Deschiderea cavităţii corpului în care se găsesc viscerele.

Cu foarfeca se urmăreşte pornind de la dreapta spre stânga, marginea îngroşată a mantalei care tiveşte peristomul dorsal, între cochilie şi picior şi părăsind-o apoi se crestează cu atenţie epiteliul ce înveleşte masa viscerală. Cu două ace cu gămălie se fixează capul şi extremitatea posterioară a piciorului pe parafina vasului de disecţie şi se răsfrînge pe dreapta mantaua, fixându-se de fundul ceruit al castronului în acelaşi mod. Cavitatea paleală astfel deschisă lasă să se vadă în interior organele care formează complexul paleal. Pentru a se descoperi cavitatea viscerală se taie cu foarfeca podeaua cavităţii paleale, inclusiv marginea îngroşată a mantalei, şi se continuă incizia peretelui dorsal al corpului până între antene cu grijă pentru a nu afecta organele interne. Pereţii se dau în lături şi se prind în ace de parafina vasului de disecţie se studiază aparatul genital care se etalează pe dreapta animalului, tubul digestiv pe stânga şi sistemul nervos. În detaşarea aparatului genital care se dă la o parte, părţile constitutive fiind ulterior desfăcute, o atenţie deosebită trebuie acordată receptacolului seminal, care apare primul în vecinătatea cavităţii paleale şi poate fi uşor atins, glandei albuminipare, friabilă şi gonadei hermafrodite, îngropată în lobul spiral al hepatopancreasului pe faţa dinspre columelă. Examinarea tubului digestiv cere detaşarea intestinului din hepatopancreas, operaţie care trebuie făcută cu prudenţă, ansele lui fiind săpate în globul mare al glandei digestive.

Pentru reuşita disecţiei se recomandă ca ea să se facă sub apă permanent limpede, şi de aceea schimbată des.

Cochilia, de foarte multe ori poate conduce la determinarea speciilor şi numai rareori este necesară disecţia. Când avem de-a face cu exemplare unice nu trebuie să uităm că prin disecţie, de multe ori cochilia este sacrificată şi nu mai putem avea încă o lecţie martorul determinării noastre. Folosindu-se microscopul electronic cu baleiaj s-a constatat că majoritatea speciilor pot fi determinate şi după cochilie, aceasta având caractere evidente de diferenţiere.

Conservarea Odată terminate toate aceste pregătiri, melcii vor fi puşi în cutii sau tuburi de sticlă de dimensiuni diferite după mărimea animalului sau se pot păstra în pungi de plastic. Tuturor li se vor pune etichete care vor cuprinde numele speciei, localitatea de colectare, biotopul, data.

Oligochete

Se colectează uşor când timpul este ploios şi râmele ies la suprafaţa solului. În timpul aratului, de asemenea pot fi colectate multe exemplare sau, vărsând formol diluat pe sol, râmele ies la suprafaţă. Râmele colectate se transportă la laborator în sol umed sau între muşchi umezi. În laborator se spală animalele cu apă, apoi se anesteziază adăugând cloroform sau formol 40 % în apa în care se găsesc râmele. Pentru întinderea corpului se folosesc măsuţe speciale, făcute din scândură sau material plastic prevăzute cu şanţuri semicilindrice de grosimea râmelor. Râmele se întind în aceste şanţuri şi se varsă lichid conservant (alcool 70 %, formol 4 %) peste ele. După o oră animalele se întăresc în poziţia întinsă. Materialul fixat se pune în borcane de înălţime corespunzătoare în alcool 80 % sau formol 4 %.

Pentru fixare histologică se utilizează sublimat acetic, Duboscq-Brasil, Zenker. În prealabil râmele trebuie ţinute câteva zile între hârtii de filtru, cârpe umede sau se hrănesc cu cicoare, pentru eliminarea pământului din intestin care ar deteriora biciul microtomului. Secţiunile se colorează cu carmin boracic alcoolic sau carmin alunat, după care se diferenţiază, se deshidratează apoi se montează.

Morfologia internă se studiază prin disecţie. Animalul se omoară în apă cloroformizată apoi se aşează cu faţa dorsală în sus în vasul pentru disecţie , în care am pus apă sau de preferinţă o soluţie de 0,43 % NaCl. Animalul se fixează prin ace cu gămălie, pe partea anterioară între segmentele I – II şi la cea posterioară. Viermele se întinde treptat, cât se poate fără să-l rupem. Incizia se execută cu o foarfecă fină, pornind de la partea anterioară pe linia mediană dorsală indicată de vasul dorsal, cât mai superficial. Către partea posterioară incizia se face puţin mai lateral. O atenţie deosebită este necesară la segmentele anterioare pentru ganglionii cerebroizi şi de acolo de unde intestinul este lipit de musculatură.

După deschiderea cavităţii corpului, cu un bisturiu sau un ac cu gămălie, înfipte optic. Dacă este necesar tăiem disepimentele care separă segmentele. Observăm sistemul digestiv, sistemul circulator, şi sistemul excretor cu ochiul liber. Nefrostomii stau la partea anterioară a peretelui disepimentului, ei se observă prin tragerea cu atenţie a intestinului în lături. La deschiderea cavităţii corpului ne frapează trei perechi de vezicule mari, alb gălbui situate în segmentele IX-XIII sunt veziculele seminale. Înlăturând esofagul se observă cu ajutorul unei lupe două perechi de testicule mici. Lanţul ganglionar ventral se pune în evidenţă prin ridicarea tubului digestiv şi pipetarea pe el a unei soluţii de acid azotic (1%).

Araneide

Araneidele sunt animale terestre, ele se colectează la nivelul solului, în iarbă, pe frunzar, pe nisip, în zone pietroase, în ierbate, pe malul râurilor, pe malul lacurilor, bălţilor, în zone mlăştinoase, pe sub pietre. Colectarea se face în cea mai mare parte cu mâna prin căutări active în diferite biotopuri, acesta fiind cel mai eficace mod de obţinere. Se mai pot folosi pensa, fileul entomologic, tuburi şi capcanele de tip Barber care dau rezultate bune. Îngropăm în sol un borcan de sticlă sau un recipient similar de tablă, astfel încât deschiderea să fie puţin sub nivelul solului. Umplem borcanul până la 1/3 cu formalină 4 % şi îl acoperim cu un pătrat de tablă cu două picioare (ridicat 4 cm deasupra nivelului solului) sau cu o şipcă de lemn pătrată sprijinită pe pietre pentru a evita umplerea cu apă în caz de ploaie. Putem instala astfel un număr de 10-25 de capcane într-o staţiune, distanţate la 1-5 m, una de cealaltă, pe două şiruri, în cruce sau în pătrat.

Procedeul de colectare utilizat depinde de scopul urmărit: întocmirea colecţiilor, material pentru studiu comparativ, observaţii ecologice, păstrarea lor în viaţă până la laborator pentru studii anatomice, histologice, biochimice, etc. animalele capturate le punem în tuburi de sticlă mici, cu alcool 75 %, închise cu dop de plută sau vată. Se introduc în tuburi etichete, menţionând localitatea, data capturării şi indicaţii ecologice. Tuburile cu dop de vată se păstrează în borcane mai mari, închise cu dop rodat şi umplute cu alcool 75 %. Cercetarea în laborator constă în studiul la binocular şi microscop şi în utilizarea unor tehnici de preparare.

În studiul adulţilor se urmăresc principalele caractere de morfologie externă de date de prosomă şi opistosomă. Aceste caracteristici atât calitative (culoarea, forma generală, structura genitaliilor), cât şi cele cantitative (denticuli chelicerali, raporturi ale lungimii sau lăţimii unor structuri), servesc la diferenţierea şi descrierea speciilor. Pentru determinare se examinează păianjeni la lupa binoculară într-un vas de sticlă (Petri) mic în alcool.

Dacă palpul masculului nu se distinge bine, se desprinde cu acele de disecţie; în caz că nu se văd unele detalii ale scleritelor palpului, se pune palpul în KOH 10-20 %, observându-l sub binocular, până ce se umflă hematodoca şi palpul se dechide bine. În privinţa epiginei femelei, dacă avem nevoie de alte caractere interne, tăiem epigina atent cu un bisturiu foarte fin sau o desprindem de pe abdomen cu acele de disecţie. Se trece apoi (cu o pensă fină sau cu o pipetă) în KOH 20 % şi se observă sub binocular până ce se obţine clarificarea dorită şi se disting bine spermatecile, orificiile de fecundare şi canalele de fertilizare. Studiul armăturilor genitale se face pe preparate provizorii sau pe preparate montate definitiv, după disecţie executată la lupa binoculară.

Disecţia – pentru această operaţie se preferă animale mari. În prealabil anesteziem păienjenii cu eter sau cu cloroform şi apoi incizăm dorsal opistosoma şi prosoma pe una din laturile lor sau ridicăm ca un capac tegumentul dorsal, servindu-ne de instrumente fine şi de un castron cu apă în care executăm toată disecţia. După desfacerea cavităţii corpului se observă organizaţia internă. În preparatele provizorii, piesa ce urmează a fi schiţată se introduce într-o picătură de glicerină, pe o lamă de alveolă, care are avantajul că permite studierea piesei sub orice unghi fără a altera poziţia unor componente structurale sub presiunea lamelei. Atât palpul cât şi epigina clarificată pot fi păstrate definitiv făcând un preparat pe lamă. Se pune pe lamă o picătură de lichid Faure, apoi se aşează în picătură palpul sau epigina clarificate, spălate în prealabil (pentru a elimina KOH) în apă acidulată. După ce am aşezat obiectul în poziţia dorită şi am îndepărtat bulele de aer, coborâm peste picătură lamela pe care am pus în prealabil un strat de lichid Faure.

În general preparatele pe lamă ale pedipalpului mascul nu reuşesc bine (scleritele se deplasează artificial), de aceea este preferabil să-l păstrăm în alcool.

Crustacee

Mijloacele de captură variază după caracteristica locului de refugiu. Pentru frunzar şi terenuri pământoase, humice, se întinde pe jos o pânză albă de 1,5/1,5 m. Cu lopata se pune în mijlocul pânzei o cantitate din materialul în care căutăm izopode (frunzar, pământ) şi scormonim în el, preluând izopodele cu o pensă foarte elastică. Multe izopode se răspândesc pe pânza albă de pe care le colectăm. Colectarea se poate face şi cu un tub aspirator. Pentru cercetarea unei cantităţi mari de material folosim pe teren sita Racoviţă. Această sită constă dintr-un sac de pânză cu diametrul de 20-25 cm, lung de 55-60 cm, împărţit transversal în două printr-o sită de sârmă cu ochiuri între cinci şi zece mm. În partea de sus a sacului se pune materialul în care căutăm izopode, apoi cernem. Prin sită trece materialul mărunt în compartimentul inferior al sacului a cărui deschidere este legată cu sfoară. Materialul rămas în compartimentul de sus este aruncat, nu fără a fi examinat pentru a vedea dacă n-au rămas acolo izopode mici. Când în compartimentul inferior s-a adunat o cantitate apreciabilă de material îl deschidem şi-l vărsăm pe o pânză albă şi culegem izopodele. Când condiţiile ne permit transportăm materialul brut în laborator unde îl supunem triajului prin aparate Tullgren. Pentru colectarea izopodelor de sub pietre trebuie luate măsuri de a nu pierde prea mulţi indivizi, deoarece ei fug imediat. Pentru a nu risca, apăsăm repede şi uşor cu degetul pe câţi putem. La această apăsare ei rămân imobili un timp şi îi putem culege. Un auxiliar preţios este o şurubelniţă mare, cam 25 cm lungime, cu care se poate scormoni foarte bine frunzarul şi pământul. În locurile unde colectarea este mai dificilă, izopodele având locuri de retragere unde nu putem cerceta, se folosesc diferite momeli şi capcane pentru atragerea şi prinderea lor.

După colectare crustaceii se fixează în formol 4 %, iar pentru păstrare se trec în alcool 75 ⁰ sau se strâng direct în alcool 70-75 ⁰, trecându-i apoi în alcool 90⁰. Conservarea se face în tuburi riguros etichetate cu indicaţii asupra locului, biotopului şi datei capturii. Mai multe tuburi astupate, fiecare cu dop de vată se pot păstra într-un borcan cu alcool, ermetic închis.

Determinarea speciilor constituie partea cea mai grea a studiului deoarece caracterele lor distinctive sunt de cele mai multe ori reprezentate prin detalii de conformare a diferitelor apendice, printre care un rol important îl au piesele bucale. Pentru o determinare riguroasă se procedează astfel: animalul se disecă cu ajutorul a două ace la o lupă binocular, detaşându-se diferitele apendice de pe o parte a corpului (de obicei de pe partea stângă); acestea, pe măsura disecării lor, sunt aşezate într-o picătură de glicerină diluată cu alcool şi pusă pe o lamă de sticlă. În timpul disecţiei se caută ca restul corpului să nu fie rupt, iar apendicele să fie întregi. Apendicele absolut necesare determinării sunt:antenele, piesele bucale, cele două perechi de gnatopode, pereiopodul V, uropodul III, telsonul, etc. Este mai practic a se scoate piesele bucale în bloc şi a le diseca apoi într-o picătură de glicerină diluată. Toate apendicele menţionate mai sus trebuie aşezate în poziţia şi ordinea lor naturală , şi examinate la microscop, în vederea determinării familiei, genului şi speciei. Paralel se va studia forma lobilor cefalici, înarmarea urosomului şi plăcilor epimerale. Măsurătoarea animalului se face la binocular, cu ajutorul unui compas fin, scoţându-se drept lungimea animalului, distanţa dintre vârful rostrului frontal şi vârful telsonului.

Organizaţia internă se studiază pe disecţie. Disecţia se face sub apă. Animalele se cloroformizează. Pentru evidenţierea organizaţiei interne, se înlătură cu ajutorul unui bisturiu membrana moale care leagă partea superioară a cefalotoracelui dinapoi înainte. Se separă dinapoi înainte organele interne pe lama mediană a cefalotoracelui rămasă pe loc după care se înlătură prin două mici tăieturi transversale. Se secţionează apoi succesiv dinainte înapoi latura dorsală a fiecărui inel abdominal. Se descoperă astfel partea dorsală a corpului. Se observă aparatul circulator, digestiv, genital, excretor şi sistemul nervos. Pentru studiul stomacului cu importanţă în taxonomie, acesta se izolează, se pune pentru câteva ore în soluţie de KOH caldă, se spală, se colorează cu pyrogalol şi se montează pe lamă. Aparatul genital se etalează în castronul de disecţie pe partea stângă a animalului secţionând la nivelul canalului deferent, respectiv oviductul drept.

După etalarea organelor din cavitatea corpului şi după îndepărtarea musculaturii pe fundalul disecţiei rămâne sistemul nervos.

Chilopode

Chilopodele se pot colecta în tot timpul anului. Cele mai bune rezultate se obţin primăvara şi toamna, când se întâlnesc aproape numai forme adulte şi larve în primele stadii de dezvoltare, care se pot distinge cu multă uşurinţă de adulţi.

Cele mai potrivite biotopuri pentru a colecta chilopode sunt pădurile. În pădurile de fag şi mai ales în pătura de frunzar mort din aceste păduri se întâlnesc cele mai multe şi mai felurite forme.

Colectarea lor în majoritatea cazurilor se poate face prin prinderea directă cu ajutorul unei pense elastice şi fine. Unele specii din frunzar pot fi colectate astfel: frunzarul la faţa locului poate fi pus pe o bucată de pânză albă şi din el se pot culege diferitele specii. Frunzarul poate fi transportat în săculeţe şi triat cu ajutorul aparatului Tullgren. În multe cazuri se poate cerne frunzarul la faţa locului colectând pe loc chilopodele.

Formele colectate se conservă în alcool 60-80%. Pe teren trebuie folosite tuburi numeroase şi de dimensiuni diferite. Formele capturate se vor introduce întotdeauna în tuburi corespunzătoare. Formolul de 4% se poate întrebuinţa drept lichid conservant uneori. Acesta întăreşte însă indivizii colectaţi, astfel încât apendicele îşi pierde elasticitatea şi la determinare se rupe cu multă uşurinţă. Materialul colectat şi triat se aşează în tubuşoare care se astupă cu dop de vată. Mai multe tubuşoare se pun într-un borcan, care se închide ermetic. În momentul când alcoolul se colorează acesta se înlocuieşte cu altul proaspăt.

Organizaţia internă se studiază pe disecţie. Se anesteziază animalul cu eter sau cloroform, apoi se aşează într-un vas mic de disecţie cu faţa dorsală în sus şi se fixează la cele două extremităţi prin ace cu gămălie. Cu o foarfece fină se incizează tegumentul pe laturi sau pe una din ele, începând din regiunea posterioară până la cea anterioară; se decupează partea dorsală ca un capac sau se rabate pe o latură prinzându-se în ace.